如果你的引物設(shè)計在了跨兩個外顯子的區(qū)域，則只能擴(kuò)增cDNA而不擴(kuò)增基因組引物不跨外顯子設(shè)計也可以，但是必須保證你用的逆轉(zhuǎn)錄試劑盒里面的gDNA Wiper 可以完全去除你的基因組，你實(shí)驗(yàn)的時候可以做一個NRT的對照看一下有。

GATCC是BglII限制性內(nèi)切酶的酶切位點(diǎn)，有可能輸入錯誤，正確應(yīng)該是GATCT， TTTTTGGAAA是設(shè)計加上的特異性堿基，一般shRNA設(shè)計有固定的堿基，比如后面三個A，參考設(shè)計吧。

應(yīng)該不是輸入錯誤GATCC是故意設(shè)計的，這樣正確連接上shRNA的質(zhì)粒就不會被BalII切斷，可以以此來驗(yàn)證shRNA有沒有被連接上自連的質(zhì)粒會被BglII切斷成linear的通過跑膠就能看出區(qū)別。

siRNA和shRNA的設(shè)計有何區(qū)別 siRNA是小干擾rnashRNA是小發(fā)卡rna，一段rna單鏈，形成莖環(huán)結(jié)構(gòu)部分雙鏈的小rna siRNA可以是天然產(chǎn)生也可以是人工導(dǎo)入的，shRNA一般都是指人工的 shRNA多是用dna載體構(gòu)建，在宿主內(nèi)自行轉(zhuǎn)錄成。

miRNA是低等和高等生物都存在的 作用在靶基因的mRNA 3’UTR區(qū)域 通過降解或者抑制翻譯來抑制靶基因表達(dá) 一條miRNA可以有多個靶基因 siRNA主要存在于低等生物 可以作用在靶基因的mRNA任何地方 通過降解來抑制表達(dá) 一般一條siRNA。